新霉素(neomycin)是1949年于费氏链霉菌产物中分离得到的一种氨基糖苷类抗生素,也是第一个被发现的含有2-脱氧链霉胺(2-DOS)的氨基糖苷类抗生素。因其具有广谱的抑菌性,在临床药物和兽用医药、饲料添加剂等领域被广泛应用。近年来,新霉素生物合成途径及该途径中的1 1种重要酶类均已被报道。本研究通过调研选取其中的5种酶基因(neoC,neoD,neoF,neoM,neoN)作为研究对象,筛选得到新霉素高产出发菌株SF,构建含有酶基因的过表达质粒以及基因阻断质粒,建立并优化大肠杆菌—费氏链霉菌接合转移体系,最终得到10株费氏链霉菌重组菌株—基因过表达重组菌株SF-neoC、SF-neoD、SF-neoF、SF-neoM、SF-neoN和基因阻断重组菌株 SF-△neoC、SF-△neoD、SF-△neoF、SF-△neoM、SF-△neoN,确定了neoN基因为新霉素生物合成过程中对新霉素产量影响较大的基因,并得到了新霉素效价达到14150U/mL的新霉素高产重组菌株。主要研究内容和结果如下:(1)新霉素高产出发菌株的筛选与分析。建立HPLC检测新霉素的方法,当新霉素标准品的效价在0～400U/mL时,峰面积与新霉素效价成良好的线性关系,线性标准曲线为Y=15485.838X-60137.88207(R2=0.999),并筛选出一株新霉素效价为11264U/mL的菌株费氏链霉菌SF,其最适固体培养基是RG培养基;最适液体培养基为YEME培养基;其于最适液体培养基中,生长曲线符合细菌生长特性;其对新霉素不敏感,对氨苄霉素、链霉素、卡那霉素较敏感,对氯霉素、安普霉素敏感,其中对安普霉素最敏感。(2)重组质粒的构建。本研究以质粒pSET152、PKC1139为基础,构建带有链霉菌强启动子ermE*基因的重组质粒Pset152-PermE*以及在此基础上添加RBS原件的重组质粒Pset152-PermE*-RBS,最后成功构建含有对应酶基因的过表达质粒PPR-neoC、PPR-neoD、PPR-neoF、PPR-neoM、PPR-neoN以及基因阻断质粒PKC-neoC、PKC-neoD、PKC-neoF、PKC-neoM、PKC-neoN,并将重组质粒导入接合转移用大肠杆菌E.coli ET12567(pUZ8002)中。(3)费氏链霉菌接合转移体系的建立与优化。本研究建立并优化了大肠杆菌—费氏链霉菌接合转移体系,其过程中接合转移最适培养基为A75培养基,受体孢子的最适预处理条件为50℃热激10 min,37℃预培养4 h,最适供受体比例为10:1,安普霉素最适添加时间为接合转移后15 h,使用最优条件后接合转移频率明显提高。且得到neoC基因过表达的重组菌株SF-neoC。(4)费氏链霉菌基因过表达与阻断菌株的构建。通过改造得到10株重组菌,分别命名为过表达重组菌SF-neoC、SF-neoD、SF-neoF、SF-neoM、SF-neoN及阻断重组菌SF-△neoC、SF-△neoD、SF-△neoF、SF-△neoM、SF-△neoN。同时与出发菌株相比,重组菌株均表现出一定程度的安普霉素抗性。基因过表达重组菌株SF-neoC、SF-neoD、SF-neoF、SF-neoM、SF-neoN的新霉素产量均得到提高,分别提高了19.27%、21.06%、20.72%、15.96%、23.07%,同时葡萄糖浓度和粘度也发生变化;阻断重组菌中SF-△neoC、SF-△neoD、SF-△neoF、SF-△neoM的新霉素效价均都降低,仅6000U/mL左右,只有SF-△neoN因为neoN基因的特性,其新霉素效价反而提高了 13.91%,但是基因阻断重组菌株的发酵液中葡萄糖浓度和粘度与出发菌株SF均无明显差别。且新霉素高产的重组菌株SF-neon和SF-△neoN传代4次后,其新霉素效价稳定。
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